Wako和光纯药 Phos-tag™ 实验设计及应用实例

Wako和光纯药 Phos-tag™ 实验设计及应用实例

◆研究领域

磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究

◆Phos-tag™ 的简介

Phos-tag™是由日本广岛大学的Kinoshita教授团队研发的磷酸化蛋白捕获分子。Phos-tag™ 螯合Zn2+或者Mn2+重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下,该空间恰好能容纳一个磷酸基团,使得螯合有金属离子的Phos-tag™ 分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团,广泛运用于细菌,酵母,昆虫等物种研究。

◆Phos-tag™ 系列产品

利用螯合有金属离子的Phos-tag™ 可以特异性结合磷酸化基团的特点,研发了Phos-tag™ 系列产品,运用于常见的蛋白实验,比如SDS-PAGE、免疫印迹、亲和层析以及质谱等。

提示:除Phos-tag™ Mass Analytical kit之外,其他Phos-tag™ 系列产品都需要配制金属离子(Zn2+或者Mn2+)溶液。

◆具体实例

1. 体外激酶反应,激酶和底物都带有标签,反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物,如何检测底物的磷酸化情况?

如果底物和激酶分子量差别大,条带通过普通的SDS-PAGE能够区分,建议进行普通SDS-PAGE后再使用Phos-tag™ Biotin进行Western Blotting。在Western Blotting实验中,使用Phos-tag™ Biotin作为“抗体”检测底物磷酸化基团(需记录底物的条带位置)。可通过剥离(strip)方式剥离Phos-tag™ Biotin,用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

如果底物和激酶分子量差别不大,可进行Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验,然后转膜,用底物的非磷酸化抗体检测(没有使用激酶的抗体,所以检测不到激酶的带)。在Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离,用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后,观察所有的条带,非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tag™丙烯酰胺结合,所以迁移速度较快,磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化,分析磷酸化底物的含量。

备注:

1) Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验中,建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221)作为阳性对照,该产品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein,确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2)如果没有非磷酸化底物,可使用AlkalinePhosphatase(for Biochemistry)(018-10693)对底物进行去磷酸化反应。

2. 如何检测EGF(表皮生长因子)刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平?

收集EGF刺激的细胞,制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验,转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测(检测所有的MAPK,包括磷酸化和非磷酸化)。正常SDS-PAGE实验中,磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离,而在Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离,所以转膜后,用MAPK抗体检测,可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验,多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

备注:该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化,细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细胞内不含有磷酸化的MAPK,则无法用Phos-tag™ 丙烯酰胺分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

3. 研究蛋白相互作用的实验中,构建带有不同标签的2种融合蛋白,共转染细胞,在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标签的亲和层析柱获得纯化的蛋白,是否可用Phos-tag™ Agarose纯化,进行后续免疫共沉淀(Co-IP)实验?

Phos-tag™ Agarose纯化磷酸化蛋白,采用高盐的洗脱方式,没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱,蛋白不发生变性,可进行后续的Co-IP实验。

 

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白,分子量很接近,如何使用Phos-tag™ 产品检测磷酸化?

如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近,通过正常的SDS-PAGE实验无法区分,建议使用Phos-tag™ 丙烯酰胺。进行Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

也可以使用Phos-tag™ Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后,先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测,剥离(strip)后用Phos-tag™ Biotin。如果磷酸化蛋白量少的话,剥离(strip)会去除一些蛋白,可能会影响检测的效果。

5. 使用Phos-tag™ Mass Analytical kit,样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响?

该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高,样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tag™ 结合。

◆产品列表

Wako SuperSep Phos-tag 丙烯酰胺预制胶

Wako SuperSep Phos-tag 丙烯酰胺预制胶

包装:5块
英文名:SuperSep Phos-tag
别名:丙烯酰胺预制胶
品牌:Wako

SuperSep Phos-tag 丙烯酰胺预制胶,内含50uM Phos-tag丙烯酰胺,可用于磷酸化蛋白的分离。预制胶中含有锌作为金属离子,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记,在中性凝胶缓冲液中保存稳定性很好,结果条带清晰。预制胶打开包装即可直接使用。根据实验条件,Phos-tag预制胶有多款丙烯酰胺浓度和孔数可选,提供专门适合BioRad和Life Technologies电泳槽尺寸的预制胶。上海金畔生物提示:我司所销售的化学试剂、原料等所有产品(包括但不限于抗生素类、蛋白质类、试剂盒类产品等)仅限用于科学研究用途,不得作用于人体。

SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶
SuperSep Phos-tag即丙烯酰胺预制胶
SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶,内含50uMPhos-tag丙烯酰胺,可用于磷酸化蛋白的分离。预制胶中含有锌作为金属离子,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记,在中性凝胶缓冲液中保存稳定性很好,结果条带清晰。预制胶打开包装即可直接使用。根据实验条件,Phos-tag预制胶有多款丙烯酰胺浓度和孔数可选,提供专门适合BioRad和Life Technologies电泳槽尺寸的预制胶。
Phos-tag磷酸化亲和电泳原理
Phos-tag<sup>™</sup>磷酸化亲和电泳原理
SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶产品特点:
■ 即开即用 – 节约最宝贵的时间
■ 根据磷酸化程度分离磷酸化蛋白
■ 分离效果好,条带清晰
■ 无需磷酸化特异性抗体和放射性同位素标记
SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶案例:
(1)分离磷酸化和去磷酸蛋白
分离磷酸化和脱磷酸蛋白
[电泳缓冲液]
Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液[电泳样品]
条带1: 未处理白蛋白
条带2: 去磷酸化白蛋白[电泳条件] 20 mA, 70分钟
[染色] CBB快速染色
[脱色] 去离子水

白蛋白(Wako# 010-17071)的去磷酸化,采用的是碱性磷酸酶(日本基因公司,货号319-02661)。条带迁移证明去磷酸化完成。

(2)去磷酸化过程
去磷酸化过程
[电泳缓冲液]
Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液[电泳样品]
条带1: β-酪蛋白 (碱性磷酸酶处理, 0 分钟)
条带2: β-酪蛋白 (碱性磷酸酶处理, 15 分钟)
条带3: β-酪蛋白 (碱性磷酸酶处理, 30 分钟)
条带4: β-酪蛋白 (碱性磷酸酶处理, 45 分钟)
条带5: β-酪蛋白 (碱性磷酸酶处理, 60 分钟)[电泳条件] 35 mA, 60分钟
[染色] CBB快速染色
[脱色] 去离子水β-酪蛋白按时间序列进行去磷酸化。结果证明磷酸化和去磷酸化β-酪蛋白分离开了。同时验证去磷酸化程度与时间相关。

SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶产品列表
1、适用于Bio-Rad电泳槽的预制胶
Product Name Wako Cat. No. Pkg. Size
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 17 wells 83 x 100 x 3.9 mm
198-17981
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 wells 83 x 100 x 3.9 mm
195-17991
5 gels
2、适用于Life-technology电泳槽的预制胶
Product Name Wako Cat. No. Pkg. Size
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 17 wells 100 x 100 x 6.6 mm
192-18001
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 wells 100 x 100 x 6.6 mm
199-18011
5 gels
3、适用于wako电泳槽的预制胶(>90 x 85 x 1 mm)
Product Name Well Wako Cat. No. Pkg. Size
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 6%
13 wells
192-17401
5 gels
17 wells
199-17391
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%
13 wells
195-17371
5 gels
17 wells
192-17381
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%
13 wells
193-16711
5 gels
17 wells
190-16721
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%
13 wells
195-16391
5 gels
17 wells
193-16571
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%
13 wells
193-16691
5 gels
17 wells
196-16701
5 gels
SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%
13 wells
197-16851
5 gels
17 wells
194-16861
5 gels
SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶使用须知
样品制备:
Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感,尤其是螯合剂,钒酸,无机盐,表面活性剂这类物质。
强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。转膜前处理:
另一个必须的步骤是在转膜前,用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或者Zn2+); 该步骤可提高蛋白的转膜效率。

  1. 分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。
  2. 将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,至少20分钟,温和摇晃。更换新缓冲液,重复3次。
  3. 将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,10分钟,温和摇晃。
  4. 转膜操作*。

* 建议用湿法转膜,以提高转膜效率。

转膜前处理
SuperSep Phos-tag丙烯酰胺预制胶质量控制
每一批SuperSep Phos-tag™,出厂前均据产品规格进行测试,以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白,且分离程度在正常参数内。
Phos-tag(TM)其它相关产品
  • Phos-tag 丙烯酰胺
  • Phos-tag 琼脂糖
  • Phos-tag 质谱分析试剂盒
  • Phos-tag 生物素
  • SuperSep Phos-tag 预制胶
  • Phos-tag 琼脂糖吸管
品牌 产品编号 产品名称 等级 规格 零售价(RMB)
Wako 193-16571 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%,17 well Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,12.5%,17孔 5块 3,370.00
Wako 193-16691 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%,13 well    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,15%,13孔 5块 3,370.00
Wako 197-16851 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%,13 well     Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,17.5%,13孔 5块 3,370.00
Wako 190-16721 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%,17 well 5块 3,370.00
Wako 194-16861 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%,17 well    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,17.5%,17孔 5块 3,370.00
Wako 198-17981 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,7.5%,17孔,BioRad型 for Electrophoresis 5 EA 3,370.00
Wako 195-17991 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,12.5%,17孔,BioRad型 for Electrophoresis 5 EA 3,370.00
Wako 192-18001 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,7.5%,17孔,Life Technologies型 for Electrophoresis 5 EA 3,370.00
Wako 199-18011 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,12.5%,17孔,Life Technologies型 for Electrophoresis 5 EA 3,370.00
Wako 195-16391 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%,13 well    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,12.5%,13孔 5块 3,370.00
Wako 192-17381 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,7.5%,17孔 5块 3,370.00
Wako 192-17401 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 6%, 13well   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,6%,13孔 5块 3,370.00
Wako 193-16711 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%,13 well    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,10%,13孔 for Electrophoresis 5 EA 3,370.00
Wako 195-17371 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 13well    Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,7.5%,13孔 5块 3,370.00
Wako 199-17391 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 6%, 17well  Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,6%,17孔 5块 3,370.00
Wako 196-16701 SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%,17 well   Phos-tag™ 预制胶50μmol/l,15%,17孔 5块 3,370.00

Wako Phos-tag-用于磷酸化蛋白分析使用问题与解答

Wako Phos-tag-用于磷酸化蛋白分析使用问题与解答

1.     Phos-tag® Acrylamide的溶解

5mmmol/ Phos-tag® 液体 (3v/v% 甲醇):

1)    10mg  Phos-tag® Acrylamide 里加入 0.1mL 甲醇

2)    使用枪头搅拌混合直至完全溶解。

3)     加3.2mL 蒸馏水, 用枪头混匀。

2-8℃避光保存。不适合零度以下保存。建议保存时间6个月。

   注意:避免溶解过程出现白色悬浮颗粒。

2.     α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221),阳性对照(含有磷酸化和非磷酸化

   α-Casein),如何使用?

   用水或者上样buffer溶解。用水溶解后,冷冻保存。电泳条件:Phos-tag® 50umol/L,分离胶浓度 10%。

   电流:30mM,1小时。

 

3.     用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)(018-10693)进行磷酸化蛋白的去磷酸化反应体系。

37℃,过夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 μL
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 μL
# Sterilized water 39 μL
# Alkaline phosphatase(018-10693). 0.3 unit / 1 μL有一点需要注意:ALP活性化使用Mg离子,

   同的非磷酸化蛋白质用ALP处理的样品的条带和没有用ALP处理的样品的条带的位置不同。

 

4.     Phos-tag® SDS-PAGE实验没有成功分离磷酸化蛋白:

1) 使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221)作为阳性对照,确认实验条

件和试剂均没有问题。

2) 可使用Phos-tag®Biotin检测样品中是否有磷酸化蛋白。确认有磷酸化蛋白后,再通过

Phos-tag ®SDS-PAGE进行分离鉴定。

3) 经质谱鉴定有表达磷酸化蛋白,建议增大样品的含量,可使用Phos-tag ®Agarose进行磷酸化蛋白

的富集。磷酸化蛋白含量过低,会影响其分离效果。

4) 文献报道有表达磷酸化蛋白,或者同源蛋白有表达磷酸化蛋白的,建议用Phos-tag® Biotin先确认

样品中是否有磷酸化蛋白。

5) 建议样品的pH值在7左右。酸性或者碱性条件下,Mn2+-Phos-tag®与磷酸化基团的特异性结合较

差。

6) 避免样品中含有高浓度的还原剂,变性剂,表面活性剂等。β-巯基乙醇浓度不高于0.2M(或者5%)。

7) 进行Phos-tag® SDS-PAGE的最佳样品是纯化的蛋白。如果是细胞裂解液,体外激酶反应液,组织均

浆液等,需要摸索最佳的分离胶,Phos-tag® Acylamide的浓度。建议Phos-tag® Acrylamide浓度

从50uM开始摸索。

 

5.     Phos-tag®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验的优化建议:

1) 可以检测的样品包括体外激酶反应体系,细胞裂解液,组织均浆液。

2) 每孔样品的上样量是10~30ug(请根据蛋白表达量进行调整)

3) 制备样品中含有的还原剂、变性剂、螯合剂、钒酸等会使电泳条带发生弯曲或者拖尾。通过TCA沉淀或

渗析法降低杂质含量。

4) 建议样品的pH值在7左右。如果加入上样缓冲液后溶液显黄色或者橙色,加入Tris缓冲液调整pH值为7。

5) 目的蛋白分子量大于60kDa,分离胶的丙烯酰胺浓度为6%;目的蛋白分子量小于60kDa,分离胶的丙烯

酰胺浓度为8%。

6) 如果样品中含有大量蛋白,比如细胞裂解液,组织均浆液,Phos-tag® Acylamide浓度为5~25uM。

若目的蛋白浓度低,建议Phos-tag® Acylamide浓度为100uM。

7) Phos-tag ®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验,湿法转膜建议:10mM EDTA的转移缓冲液

处理凝胶10min,不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。强烈建议湿法转膜

8) Phos-tag® SDS PAGE半干法转膜建议:

              i.      电泳后用含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶,EDTA的浓度为 100mM。100mM EDTA的转移

缓冲液处理凝胶10min,不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。

             ii.      转膜的电流值提高2%~3%, 延长时间2成。

            iii.      转膜的缓冲液加SDS,加到大约0.05~0.2%,转膜效率会提高。

9) 使用目的蛋白的非磷酸化抗体即可。比如检测各种肿瘤细胞系中Src激酶活性实验,用Src的非磷酸化抗

体即可。

10) 和光的WIDE-VIEWTM Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可检测作为转膜效率,但是无

法判断分子量。

11) 一般预染的蛋白marker在Phos-tag®SDS-PAGE中条带会弯曲,无法判断蛋白分子量。

12) 不能确认磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分离,请进行常规的SDS-PAGE,Western Blotting实验。比

对目的蛋白的迁移率。

13) 不能确认是因为蛋白发生磷酸化还是出现降解造成蛋白条带迁移,请进行常规的SDS-PAGE实验,确

认不会出现条带迁移。

14) 目的蛋白磷酸化与非磷酸化分离效果不佳,使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated

(038-23221)作为阳性对照,确认实验条件和试剂均没有问题。如果确认能够分离,调整分离胶,

Phos-tag® Acylamide的浓度。建议使用品质佳的MnCl2(139-00722)。

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
304-93526  Phos-tag Acrylamide AAL-107
5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液
0.3mL 蛋白研究
300-93523  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺
2mg 蛋白研究
304-93521  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺
10mg 蛋白研究
134-15302 Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化锰四水合物 25g for Molecular Biology

Wako 304-93521 Phos-tag Acrylamide(ALL-107)

Wako304-93521 Phos-tag Acrylamide(ALL-107)

货号:300-93523; 304-93521; 304-93526
包装:2mg;10mg;0.3ml

英文名:Phos-tag Acrylamide

品牌:Wako

使用Phos-tag(TM) SDS-PAGE和Phos-tag Acrylamide分离磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。

1. Phos-tag™ Acrylamide
Phos-tag Acrylamide SDS-PAGE可根据迁移率不同,区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。该方法只需在常规的SDS-PAGE胶中添加Phos-tag Acrylamide和MnCl2即可进行实验(制胶过程中添加,如需详细说明请联系我们)。
特点
# 非放射性元素,非荧光物质
# 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带
# 操作简便,与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似
# Phos-tag™ 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关
# Phos-tag™ SDS-PAGE实验后,可进行常规的免疫组化、质谱等
# 性质稳定,溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月
# 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测
# 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来
原理
WAKO 磷酸化蛋白电泳试剂Phos-tagTM 系列
应用
WAKO 磷酸化蛋白电泳试剂Phos-tagTM 系列
2. SuperSepTM Phos-tag™ 磷酸化蛋白电泳预制胶
WAKO 磷酸化蛋白电泳试剂Phos-tagTM 系列加入Phos-tagTM的预制胶,打开包装即可使用。含有锌作为补充金属。中性胶缓冲液保证了储存的稳定性。

板尺寸:100*100*3(mm)
胶尺寸:90*85*1(mm)
孔数:13孔
上样量:30ul

特点:
# 使用方便,开袋即用
# 相比使用Phos-tag™ 自己手动制胶,分离效果更好,稳定性更高

产品订购信息:

Phos-tag™ Acrylamide在配胶中的使用浓度
货号
产品名称
使用浓度
20uM
50uM
100uM
304-93526
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107 5mM水溶液
约10块
约4块
约2块
300-93523
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107
约20块
约8块
约4块
304-93521
约100块
约40块
约20块
品名 货号 包装 用途
Phos-tag(TM) Acrylamide AAL-107 300-93523 2mg 按磷酸化程度不同特异性分离磷酸化蛋白
304-93521 10mg
Phos-tag™ Acrylamide 5mM Aqeuous Solution 304-93526 0.3ml

wako 193-16711-SuperSep Phos-tag™ 预制胶

wako 193-16711-SuperSep Phos-tag™ 预制胶(蛋白磷酸化研究)

蛋白磷酸化研究的预制胶

新品速递图wako.jpg

SuperSep Phos-tag

SuperSep Phos-tag是研究蛋白磷酸化的方法,无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

◆SuperSep Phos-tag

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Phos-tag?是一种预制胶,预先加入了50 μmol/L的Phostag? Acrylamide,打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子,在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好,得到的带条结果也很整齐。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

分离后,胶可用于考马斯亮蓝染色,免疫印迹和质谱实验。

◆Phos-tag SDS-PAGE 的原理

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◆在HighWire Search 上搜索到的论文数

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◆运用

利用p35的丙氨酸突变体确定Cdk5 激活p35的磷酸化位点

p35常见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位点往往会发生丙氨酸突变,产生3种突变体(Ser8突变体:S8A,Thr138突变体:T138A,Ser8和Thr138双突变体:2A)。这3种突变体、野生型p35、Cdk5和没有激酶活性的Cdk5都来源于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE和Western blotting 进行检测(检测抗体:p35抗体)。

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100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系!

– 泳道1(条带L2和L4)和泳道5(条带M1):p35在Cdk5的作用下发生了磷酸化;

– 泳道1(条带L2和L4)和泳道3(条带L2和L4):在无激酶活性Cdk5的作用下,大约有一半p35蛋白在Thr138位点

发生磷酸化,同样在138位发生突变的p35蛋白亦是如此。

– 泳道5 (条带M1)和泳道6(条带L3和L4):Ser8和Thr138是主要的磷酸化位点;

– 泳道5(条带M1)、泳道7(条带L1和L2)和泳道8(条带M2):条带M1是Ser8和Thr138都发生磷酸化的条带;

条带M2是只有Ser8磷酸化的条带;条带L1和L2是只有Thr138磷酸化的条带。

※ 条带L1和L3中的X 是不确定哪个位点发生磷酸化的条带;

※ 条带L4是非磷酸化的p35。

【参考文献】

Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 – 1143.

【结果提供】

理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永(Dr. T. Hosokawa)

首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)

检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片段

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我们可以确定在片段中含有目的激酶!

① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1(1-290)结合蛋白

② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1(1-290)作为体外激酶实验的反应底物

④ Phos-tag  SDS-PAGE 用于Western blotting,确定迁移条带中每个片段的激酶活性

【参考文献】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J.,

【结果提供】

高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪(Dr. Y. Sugiyama)

香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇(Dr. I. Kameshita)

二维电泳中的应用:分析hnRNP K磷酸化异构体

小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后,裂解细胞,经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中,一维是IPG 胶,二维是Phos-tag ? SDS-PAGE,可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪,可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

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同一个等电点的位置上,不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

【参考文献】

? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)

理化学研究所RCAI 小原收

◆备注

样品制备:

Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感,尤其是螯合剂,钒酸,无机盐,表面活性剂这类物质。

强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。

转膜前处理:

另一个必须的步骤是在转膜前,用EDTA去除凝胶中的金属离子(Mn2+或者Zn2+);

该步骤可提高蛋白的转膜效率。

● 分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。

● 将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,至少20分钟,温和摇晃。更换新缓冲液,重复3次。

● 将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,10分钟,温和摇晃。

● 转膜操作*。

* 建议用湿法转膜,以提高转膜效率。

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◆质量控制

每一批SuperSep Phos-tag?,出厂前均根据其产品规格进行测试,以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白,以及他们的分离成都在正常参数内。

◆产品信息

用于Bio-Rad伯乐电泳仪

货号 品名 电泳仪 规格
198-17981 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well,

83×100×3.9mm

Mini-PROTEAN?

Tetra Cell

(Bio-Rad Laboratories, Inc.)

5 块
195-17991 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well,

83×100×3.9mm

5 块

用于Life Technologies电泳仪

货号 品名 电泳仪 规格
192-18001 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well,

100×100×6.6mm

XCell SureLock?

Mini-Cell

(Life Technologies, Inc.)

 

5 块
199-18011 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well,

100×100×6.6mm

5 块
产品编号 产品名称 产品规格
193-16711 SuperSep Phos-tag?  (50 μmol/L), 10%, 13 well
Phos-tag 13孔10%预制胶
5块
190-16721 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 10%, 17 well
Phos-tag 17孔10%预制胶
5块
195-16391 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 12.5%, 13 well
Phos-tag 13孔12.5%预制胶
5块
193-16571 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 12.5%, 17 well
Phos-tag 17孔12.5%预制胶
5块
193-16691 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 15%, 13 well
Phos-tag 13孔15%预制胶
5块
196-16701 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 15%, 17 well
Phos-tag 17孔15%预制胶
5块
197-16851 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 17.5%, 13 well
Phos-tag 13孔17.5%预制胶
5块
194-16861 SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 17.5%, 17 well
Phos-tag 17孔17.5%预制胶
5块
198-17981 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm
Phos-tag? 预制胶,BioRad型
5块
195-17991 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm
Phos-tag? 预制胶,BioRad型
5块
192-18001 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm
Phos-tag? 预制胶,Life Technologies型
5块
199-18011 SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm
Phos-tag? 预制胶,Life Technologies型
5块

Phos-tag™ 系列磷酸化蛋白新方法

Phos-tag™ 系列磷酸化蛋白新方法

英  文  名: Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution

产  地: 日本

商  家: Wako(和光纯药工业株式会社)

wao Phos-tag™实验设计

◆  研究领域

磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究

◆  Phos-tagTM 的简介

Phos-tagTM(Phosphate-binding tag)是由日本广岛大学的Kinoshita等研制的磷酸化蛋白蛋白捕获分子。Phos-tagTM 螯合Zn2+或者Mn2+等重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下,该空间恰好能容纳一个磷酸基团,使得螯合有金属离子的Phos-tagTM 分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团,广泛运用于细菌,酵母,昆虫等物种研究。

◆  Phos-tagTM 系列产品

利用螯合有金属离子的Phos-tagTM 可以特异性结合磷酸化基团的特点,研发了Phos-tagTM 系列产品,运用于常见的蛋白实验,比如SDS-PAGE,免疫印迹,亲和层析,质谱等。

Phos-tagTM 系列产品 产品描述 用途 具体运用实验
Phos-tagTM   Acrylamide Phos-tagTM 与丙烯酰胺(Acrylamide,SDS-PAGE分离胶主要成分)结合 分离磷酸化和非磷酸化蛋白。SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子(Zn2+或者Mn2+)和Phos-tagTM Acrylamide。在蛋白电泳过程中,磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Acrylamide发生特异性结合,导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。 SDS-PAGE(单一蛋白)

免疫印迹(多种蛋白混合液,例如细胞裂解液,组织均浆液,体外激酶反应体系。使用目的蛋白的非磷酸化抗体作为一抗)

Phos-tagTM Biotin Phos-tagTM 与生物素(Biotin)结合 可与亲和素标记的HRP结合,检测磷酸化蛋白。 免疫印迹(正常SDS-PAGE)
Phos-tagTM  Agarose Phos-tagTM 与琼脂糖(Agarose)结合 利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Agarose特异性结合,纯化磷酸化蛋白。 亲和层析法
Phos-tagTM Mass Analytical kit Phos-tagTM 与不同荷质比的Zn结合 检测微量磷酸化蛋白和磷酸化多肽。 质谱实验

备注:除Phos-tagTM Mass Analytical kit之外,其他Phos-tagTM 系列产品都需要配置金属离子溶液。

Phos-tag™ 系列磷酸化蛋白新方法!
Phos-tag™ 是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子。它可用于磷酸化蛋白的分离(Phos-tag™ Acrylamide)、Western Blot检测(Phos-tag™ Biotin)、蛋白纯化 (Phos-tag™ Agarose)及质谱分析MALDI-TOF/MS (Phos-tag™ Mass Analytical Kit)。

◆Phos-tag™ 的基本结构

特点
与-2价磷酸根离子的亲和性和选择性高于其它阴离子
在pH 5-8的生理环境下生成稳定的复合物

◆原理

◆应用

样品类型: 纯化蛋白、组织均浆液、组织裂解液、体外酶反应液
样品来源物种: 无物种特异性,可用于人、植物(拟南芥 水稻 棉花等)、动物(斑马鱼 灵长类等)、微生物(酵母 细菌 真菌等) 昆虫(果蝇 蚕等)
分离蛋白大小: 磷酸化蛋白的分离范围在十几到220kDa,文献报道可分离350kDa的磷酸化蛋白
准备的试剂和仪器: 10mM的MnCl2溶液,固体产品需要溶解于甲醇中,其余与常规SDS-PAGE相同
各包装可做实验次数: 2mg包装20μM可制约20块胶,50μM约8块;10mg包装20μM可制100块胶,50μM约40块
凝胶染色: 考马斯亮蓝、银染、荧光染色、阴性染色

相关产品

产品名称 用  途
 Phos-tag™ Acrylamide  分离: SDS – PAGE 分离不同磷酸化水平的蛋白
 SuperSep Phos-tag™  分离: 预制胶中含有50μM Phos-tag™ Acrylamide
 Phos-tag™ Biotin  检测: 代替 Western Blot 检测中的磷酸化抗体
 Phos-tag™ Agarose  纯化: 通用柱层析,纯化磷酸化蛋白
 Phos-tag™ Mass
Analytical Kit
 分析: 用于质谱 MALDI-TOF/MS 分析,提高磷酸化分子的检测灵敏度

 

Phos-tag Acrylamide(丙烯酰胺)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格 Phos-tag在配制胶中的浓度
20μM 50μM 100μM
304-93526 AAL-107S1 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution 0.3mL 约10块 约4块 约2块
300-93523 AAL-107M Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 2mg 约20块 约8块 约4块
304-93521 AAL-107 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 10mg 约100块 约40块 约20块

 

SuperSep Phos-tag™ (丙烯酰胺预制胶)

产品编号 产品名称 产品规格
193-16711 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well
Phos-tag 13孔10%预制胶
5块
190-16721 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well
Phos-tag 17孔10%预制胶
5块
195-16391 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 13 well
Phos-tag 13孔12.5%预制胶
5块
193-16571 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 17 well
Phos-tag 17孔12.5%预制胶
5块
193-16691 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well
Phos-tag 13孔15%预制胶
5块
196-16701 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well
Phos-tag 17孔15%预制胶
5块
197-16851 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 13 well
Phos-tag 13孔17.5%预制胶
5块
194-16861 SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 17 well
Phos-tag 17孔17.5%预制胶
5块
198-17981 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm
Phos-tag™ 预制胶,BioRad型
5块
195-17991 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm
Phos-tag™ 预制胶,BioRad型
5块
192-18001 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm
Phos-tag™ 预制胶,Life Technologies型
5块
199-18011 SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/l), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm
Phos-tag™ 预制胶,Life Technologies型
5块

Phos-tag™ Biotin(生物素)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
301-93531 BTL-104 Phos-tag™ Biotin BTL-104 10mg
308-97201 BTL-111S1 Phos-tag Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution 0.1ml

Phos-tag™ Agarose(琼脂糖)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
302-93561 AG-501 Phos-tag™ Agarose 0.5ml
308-93563 AG-503 Phos-tag™ Agarose 3ml

Phos-tag™ Mass Analytical Kit(质谱分析试剂盒)

产品编号 生产商编号 产品名称 规格
305-93551 MS-101KIT Phos-tag™ Mass Analytical Kit 1 set

SuperSep Phos-tag™ 预制胶即开即用!
phos-tag™ 由日本广岛大学研究生院医齿药学综合研究科医药分子功能科学研究室开发。
SuperSep Phos-tag™ 是一种预制胶,预先加入了50 μmol/L的Phos-tag™ Acrylamide,打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子,在中性凝胶缓冲液中保存稳定性很好,得到的结果条带也很整齐。

 板大小  100 x 100 x 3 (mm)
 凝胶大小  90 x 85 x 1 (mm)
 孔数  13  17
 孔容积  30 μL  25 μL
 Phos-tag™浓度  50 μmol/L
 丙烯酰胺浓度  10%、12.5%、15% 和17%
 ZnCl2浓度  100 μmol/L

 

优点、特色
·即开即用
·预制胶使用安全
·可长期保存(6个月)
·操作与普通SDS-PAGE一样

◆案例、应用
电泳条件:30 mA(恒电流), 60分钟
样品:5 ug/Lane α-酪蛋白(含磷酸化与去磷酸化α-酪蛋白)(产品编号038-23221)
普通SDS-PAGE只观察到一条条带,而Phos-tag™ SDS-PAGE里可见α-酪蛋白磷酸化和α-酪蛋白去磷酸化两条
条带。
样品缓冲液:Sample Buffer Solution (2ME+) (X4) (产品编号191-13272)
电泳缓冲液:SDS-PAGE 缓冲液, pH8.5(产品编号192-16801)
染色:QUICK CBB PLUS(产品编号174-00553)
P10%(左) : SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13well
P15%(中) : SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13well
A15%(右) : SuperSep™Ace, 15%, 13well (不含Phos-tag™)

◆相关产品

产品编号 产品名称 规  格
 058-07681  EasySeparator <配套电泳槽>  1 套
 230-02461  Wide-View Prestained Protein Size Marker III (11~245kDa)  500 μL (200 次)
 038-23221  α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated  1 mg

◆具体实例

1. 体外激酶反应,激酶和底物都带有标签,反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物,如何检测底物的磷酸化情况?

如果底物和激酶分子量差别大,通过正常的SDS-PAGE能够区分,建议使用Phos-tagTM Biotin。将激酶和底物进行免疫印迹实验,用Phos-tagTM Biotin作为抗体检测底物的磷酸化基团(需记录底物的条带位置)。可通过剥离(strip)方式剥离Phos-tagTM Biotin,用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

如果底物和激酶分子量差别不大,可进行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验,然后转膜,用底物的非磷酸化抗体检测(没有使用激酶的抗体,所以检测不到激酶的带)。在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离,用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后,观察所有的条带,非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tagTM Acrylamide结合,所以迁移速度较快,磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化,分析磷酸化底物的含量。

备注:

1) Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验中,建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-

       23221),该产品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein,确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2)如果没有非磷酸化底物,可使用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)(018-10693)对底物进行去磷酸

     化反应。

2. 如何检测EGF(表皮生长因子)刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平?

收集EGF刺激的细胞,制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验,转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测(检测所有的MAPK,包括磷酸化和非磷酸化)。正常SDS-PAGE实验中,磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离,而在Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离,所以转膜后,用MAPK抗体检测,可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验,多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

备注:该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化,细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细

          胞内不含有磷酸化的MAPK,则无法用Phos-tagTM Acrylamide分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

3. 研究蛋白相互作用的实验中,构建带有不同标签的2种融合蛋白,共转染细胞,在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标

    签的亲和层析柱获得纯化的蛋白,是否可用Phos-tagTM Agarose纯化,进行后续免疫共沉淀实验(Co-IP)实验?

Phos-tagTM Agarose纯化磷酸化蛋白,采用高盐的洗脱方式,没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱,蛋白不发生变性,可进行后续的Co-IP实验。

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白,分子量很接近,如何使用Phos-tagTM 产品检测磷酸化?

如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近,通过正常的SDS-PAGE实验无法区分,建议使用Phos-tagTMAcrylamide。进行Mn2+-Phos-tagTM SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

也可以使用Phos-tagTM Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后,先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测,剥离(strip)后用Phos-tagTM Biotin。如果磷酸化蛋白量少的 话,剥离(strip)会去除一些蛋白,可能会影响检测的效果。

5. 使用Phos-tagTM Mass Analytical kit,样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响?

该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高,样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tagTM 结合。