WAKO 亲和层析法纯化磷酸化蛋白–Phos-tag 琼脂糖

WAKO 亲和层析法纯化磷酸化蛋白–Phos-tag 琼脂糖

Phos-tagTM与琼脂糖(Agarose)结合利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Agarose特异性结合,纯化磷酸化蛋白。  Phos-tag™ Agarose可用于磷酸化蛋白通过柱层析富集,分离,纯化。不使用表面活性剂或还原剂,磷酸化蛋白可以在一个类似体内环境下获得。

Phos-tag™ Agarose为分离、浓缩天然磷酸化的蛋白和生物样品(生理条件下)中磷酸化多肽提供一种高效的方法。

Phos-tagTM Agarose可用于磷酸化蛋白通过柱层析富集,分离,纯化。不使用表面活性剂或还原剂,磷酸化蛋白可以在一个类似体内环境下获得。为分离、浓缩天然磷酸化的蛋白和生物样品(生理条件下)中磷酸化多肽提供一种高效的方法。

特点:

  • 缓冲液不含有还原剂和去污剂
  • 与亲和层析方法类似
  • 可在1小时内纯化磷酸化蛋白
  • Phos-tag™ Agarose捕获结合到Tyr、Thr、Ser、Asp、His等氨基酸、糖类、脂类上的无机磷酸根和大量二价磷酸根
  • 蛋白可在生理条件(PH7.5)下捕获
  • 无需表面活性剂和还原剂

WAKO 亲和层析法纯化磷酸化蛋白–Phos-tag 琼脂糖说明书下载

Phos-tag Agarose AG-501  [Wako Cat. #302-93561 (0.5 mL)]⇒ Protocol(点击进入下载)

Phos-tag Agarose AG-503  [Wako Cat. #308-93563 (3 mL)]⇒ Protocol点击进入下载)

Phos-tag™ Agarose亲和层析原理

应用实例
【纯化细胞裂解液中的磷酸化蛋白】

 M:标准蛋白Marker
Lane 1:全蛋白,未经纯化
Lane 2:纯化后的蛋白洗脱液
Lane 3:漂洗流出液
将Phos-tag™ Agarose填充到柱子中,加入细胞裂解液。

SYPRO Ruby染色(左图),Anti-pTyr抗体进行western blot检测(右图)。
结果显示使用Phos-tag™ Agarose可高效纯化磷酸化蛋白。

产品编号 产品名称 规格
308-99401 Phos-tag™ Agarose 0.5ml
308-93563 Phos-tag™ Agarose 3ml
产品描述

1、悬浮液填料;

2、悬浮液在4度中,可保存至少半年;

3、Phos-tagTM与琼脂糖(Agarose)结合利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Agarose特异性结合,纯化磷酸化蛋白。

可用于亲和层析法进行磷酸化蛋白纯化。

Phos-tag® Agarose为分离、浓缩天然磷酸化蛋白和生物样品中磷酸化多肽提供一种高效的方法。

提供各种规格产品,以便用于不同样品的检测。

缓冲液不含有还原剂和去污剂。与亲和层析方法类似。

Phos-tag® Agarose捕获结合到Tyr、Thr、Ser、Asp、His等氨基酸,糖类、脂类上的无机磷酸根和大量二价磷酸根。

wako 用于磷酸化蛋白的WB检测– Phos-tag™ Biotin

wako  Phos-tag™ Biotin–生物素共轭的Phos-tag,用于磷酸化蛋白的WB检测

Phos-tag™ Biotin是与生物素结合的Phos-tag™,可代替western blot检测中的磷酸化抗体。Phos-tag™ Biotin BTL-104和BTL-105可灵敏检测PVDF膜上的磷酸化蛋白。现推出液体型。

特点:

  • 无辐射
  • 无需PVDF膜的封闭处理
  • Phos-tag™的特异性结合与氨基酸种类、序列无关
  • 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续工作
  • Phos-tag™-BTL母液可稳定保存至少6个月
  • 实验流程与使用HRP标记抗体相类似
  • 可用于所有的磷酸化蛋白检测
  • 与普通WB检测相似。但无需使用磷酸化抗体
【Phos-tag™ Biotin免疫印迹原理】
应用实例:

应用实例:使用Phos-tagBTL-104进行斑点印迹检测
非磷酸化蛋白:Bovine Serum Albumin, Human Serum Albumin, Carbonic Anhydrase, β- Galactosidase
磷酸化蛋白:α-Casein, β-Casein, Ovalbumin, Pepsin
去磷酸化蛋白: (用碱性磷酸酶处理) α-Casein, β-Casein, Ovalbumin, Pepsin
Application (3): Western Blotting:
Phos-tag Biotin BTL-104 [Wako Cat. #301-93531 (10 mg)]Protocol(点击进入)

Phos-tag Biotin BTL-105 [Wako Cat. #304-93541 (10 mg)]Protocol(点击进入)
产品描述

1、粉末;

2、在4度可保存至少一年;

3、检测磷酸化蛋白;

4、Phos-tagTM与生物素(Biotin)结合可与亲和素标记的HRP结合,检测磷酸化蛋白。

可用于免疫印迹实验,二维电泳。

产品编号 产品名称 规格 原价
305-99411 Phos-tag™ Biotin BTL-104 1mM Aqueous 0.3ml 2700
308-97201 Phos-tag™ Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution 0.1ml 3560
301-93531 Phos-tag™ Biotin BTL-104 10mg 12460
308-93541 Phos-tag™ Biotin BTL-105 10mg 12460

BTL-104、BTL-105、BTL-111三者连接链(Linher)长度不一,但使用上基本相同.BTL-111灵敏度最高,推荐使用溶解性比较高的BTL-104。

Wako  Phos-tag™ Biotin–生物素共轭的Phos-tag使用的相关问题解答

Q. BTL-104,BTL-105,BTL-111 之间有什么区别?
A. BTL-104,BTL-105 和BTL-111 三者连接链(Linker) 的长度不同,但使用相同。BTL-111 灵敏度最高。

Q. 检测灵敏度到什么水平?
A. 可以达到ng 级别。需要使用高发光试剂,比如ImmunoStar LD。

Q. 使用该产品时还需要别的试剂吗?
A. 需要制备Streptavidin-conjugated HRP 溶液。

Q. Phos-tag ™ Biotin 可以使用多少次?
A. 主要决定于使用次数以及使用量,以下实验次数仅作参考
BTL-104:130-1300 次;
BTL-105:113-1130 次;
BTL-111 1 mM 水溶液:10-100 次

Q. 可测定磷酸化蛋白吗?
A. 根据条带的浓度可以进行半定量分析。

Q. 能否确定结合磷酸基团的数目?
A. 不能。

Q. 能否剥除Phos-tag ™ Biotin 中的抗体?
A. 可以。与含有62.5 mM Tris-HCl(pH6.8)、2%(w/v) SDS
和1 M 2-mercaptoethanol 溶液混合后,振荡15 分钟。将混合液用1×TBS-T 漂洗3 次,每次10 分钟。

Q. 推荐使用哪种膜?
A. 推荐使用PVDF 膜。

Q. 使用Phos-tag ™ Biotin 要求终止反应吗?
A. 不需要,因为终止反应会降低灵敏度。

Reference  参考文献

    1. “Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc (II) complex”, E. Kinoshita, M. Takahashi, H. Takeda, M. Shiro, and T. Koike, Dalton Trans., 21, 1189-1193 (2004).
    1. “Phosphate-binding tag: A new tool to visualize phosphorylated proteins”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike, Mol. Cell. Proteomics, 5, 749-757 (2006).
    1. “Detection and Quantification of On-Chip Phosphorylated Peptides by SurfacePlasmon Resonance Imaging Techniques Using a Phosphate Capture Molecule”, K. Inamori, M. Kyo, Y. Nishiya, Y. Inoue, T. Sonoda, E. Kinoshita, T. Koike, and Y. Katayama, Anal. Chem., 77, 3979-3985 (2006).
  1. “Identification on Membrane and Characterization of Phosphoproteins Using an Alkoxide-Bridged Dinuclear Metal Complex as a Phosphate-Binding Tag Molecule”, T. Nakanishi, E. Ando, M. Furuta, E. Kinoshita, E. Kikuta-Kinoshita, T. Koike, S. Tsunasawa, and O. Nishimura, J. Biomol. Tech., 18, 278-286 (2007).

Phos-tag(TM) Acrylamide Phos-tag丙烯酰胺

Phos-tag(TM) Acrylamide Phos-tag丙烯酰胺

货号:300-93523; 304-93521; 304-93526
包装:2mg;10mg;0.3ml

英文名:Phos-tag Acrylamide

品牌:Wako

使用Phos-tag(TM) SDS-PAGE和Phos-tag Acrylamide分离磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。

Phos-tag 丙烯酰胺 Phos-tag Acrylamide
使用Phos-tag 进行磷酸化蛋白质的迁移率测定
– 使用丙烯酰胺标记的Phos-tag 进行磷酸蛋白亲和电泳层析
Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag<sup>™</sup> Acrylamide
Phos-tag是由广岛大学高分子科学系开发的一种中性pH环境(生理pH)下的新型磷酸结合标记。Phos-tag SDS-PAGE这种电泳方法可以同时分析磷酸化蛋白异构体和配对二价锰的非磷酸化蛋白,是一种使用Pho-tag琼脂糖用于分离,纯化和富集磷酸化蛋白质的全新方法。该方法只需在常规的SDS-PAGE胶中添加Phos-tagAcrylamide (Phos-tag 丙烯酰胺)和锌离子或者锰离子即可实验。
Phos-tag磷酸化亲和电泳原理
Phos-tag<sup>™</sup>磷酸化亲和电泳原理
 Phos-tag  丙烯酰胺
Phos-tagTM SDS-PAGE 特点:
■ 不含放射性元素,非荧光物质
■ 不同位点磷酸化修饰的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来
■ 操作过程与常规 SDS-PAGE相类似
■ Phos-tag ™ 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关
■ Phos-tag ™ SDS-PAGE实验后,可进行常规的免疫印迹或者质谱实验,也可进行 2 维电泳
■ 可区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白
■ Phos-tag ™ 母液可稳定保存至少 3 个月
Phos-tag ™应用
Phos-tag Acrylamide - 上海金畔生物,专业的Phos-tag产品供应商
Phos-tag 丙烯酰胺 Phos-tag Acrylamide 相关产品
货号
厂商编号
产品名称
规格
304-93526
AAL-107S1
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107 5mM水溶液
0.3 ml (约0.9 mg)
300-93523
AAL-107M
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107
2 mg
304-93521
AAL-107
10 mg
Phos-tag™ Acrylamide在配胶中的使用浓度
货号
产品名称
使用浓度
20uM
50uM
100uM
304-93526
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107 5mM水溶液
约10块
约4块
约2块
300-93523
Phos-tag™ Acrylamide AAL-107
Phos-tag™ 丙烯酰胺 AAL-107
约20块
约8块
约4块
304-93521
约100块
约40块
约20块

wako Phos-tag™ Acrylamide丙烯酰胺

Phos-tag™ Acrylamide

SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白!

在不使用放射性同位素的情况下,利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分离不同条带中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分离后的凝胶可用于Western blotting和质谱分析等后续实验。

Phos-tag™ SDS-PAGE操作简单,只需在常规SDS-PAGE胶中加入Phos-tag™ Acrylamide 和Mn2+或者Zn2+即可进行实验。在电泳过程中,磷酸化蛋白的磷酸基团与Phos-tag™中的二价金属离子相结合,降低其迁移速度,从而可区分磷酸化与非磷酸化蛋白。

上海金畔生物科技有限公司

服务热线:18301939375   QQ:3258089810    3259632176

Email:  info@jinpanbio.com

◆原理

◆优点、特色

  • 采用Phos-tag™ SDS-PAGE可轻松分离磷酸化蛋白

无任何放射性元素及化学标记!

  • 可检测不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

无需任何磷酸化抗体!

  • 适用于内源性蛋白的磷酸化分析!

◆案例、应用

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比较】

我推荐使用Phos-tag ™ ——东京大学研究院医学研究科 小川觉之

Phos-tag ™ 是专为研究磷酸化蛋白而新开发出来的试剂。此产品使用方便,不但可用于体外实验,还能定量分析体内蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常规电泳实验,无需购买特殊设备,性价比高。传统蛋白磷酸化的研究需要特异的磷酸化抗体、RI 等其它试剂,操作复杂,花费大,且放射性元素会有安全隐患,而Phos-tag ™ 的出现恰恰可以弥补这些缺点,为磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分离效果图

Lane 1 为非磷酸化蛋白,Lane 2-5 为磷酸化蛋白,各蛋白因磷酸化状态不同而条带迁移率也有所不同。

磷酸化/ 非磷酸化蛋白的数量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的丰度等都可根据条带迁移和条带浓度求得。

【资料提供】

日本东京大学研究生院医学系研究科

【二维电泳中的应用:分析hnRNP K 磷酸化异构体】

小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后,裂解细胞,经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中,一维是IPG 胶,二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE,可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪,可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

二维电泳

同一个等电点的位置上,不同位点发生磷酸化都可以被区分开来(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)理化学研究所RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的变化】

常规SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印迹实验分析EGF 刺激的A431 细胞中MAPK 磷酸化水平。

摘自Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 产品价格
304-93526  Phos-tag Acrylamide AAL-107
5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液
0.3mL 蛋白研究
300-93523  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺
2mg 蛋白研究
304-93521  Phos-tag Acrylamide AAL-107
Phos-tag 丙烯酰胺
10mg 蛋白研究
134-15302 Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化锰四水合物 25g for Molecular Biology

 

wako磷酸化蛋白电泳试剂- Phos-tag (TM) Acrylamide

磷酸化蛋白电泳试剂——wako Phos-tag (TM) Acrylamide

什么是Phos-tag™

Phos-tag ™ 是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子,结合特异性与氨基酸的种类和序列无关,无放射性,无需特意制备磷酸化抗体。它可用于磷酸化蛋白的分离(Phos-tag™ Acrylamide)、Western Blot 检测(Phos-tag ™ Biotin)、蛋白纯化 (Phos-tag ™ Agarose)及质谱分析MALDI-TOF/MS (Phos-tag ™ Mass Analytical Kit) 。

Phos-tag的基本结构:

 

 

 

 

 

 

1. Phos-tag ™ Acrylamide 介绍

Phos-tag Acrylamide SDS-PAGE可根据迁移率不同,区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。该方法只需在常规的SDS-PAGE胶中添加Phos-tag Acrylamide和MnCl2即可进行实验(制胶过程中添加,如需详细说明请联系我们)。

特点
# 非放射性元素,非荧光物质
# 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带
# 操作简便,与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似
# Phos-tag™ 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关
# Phos-tag™ SDS-PAGE实验后,可进行常规的免疫组化、质谱等
# 性质稳定,溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月
# 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测
# 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来

原理

应用

1、黄色粘性油状物质;

2、在4度可保存至少一年;

3、Phos-tagTM与丙烯酰胺(Acrylamide,SDS-PAGE分离胶主要成分)结合分离磷酸化和非磷酸化蛋白。

SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子(Zn2+或者Mn2+)和Phos-tagTM Acrylamide。

在蛋白电泳过程中,磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Acrylamide发生特异性结合,导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。

Phos-tag® Acrylamide可根据迁移率不同,区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。无放射性、非化学物质标记。不同位点磷酸化修饰的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来。

操作过程与普通SDS-PAGE相类似。Phos-tagTM的特异性结合与氨基酸种类、序列无关。

适用于免疫印迹、质谱分析等后续工作。可识别磷酸化和非磷酸化蛋白。

Phos-tagTM母液可稳定保存至少3个月。

可检测出具有不同磷酸基团数目的蛋白。无需特意制备磷酸化抗体。

产品编号 产品名称 规格 原价
304-93526 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution 0.3ml 2670
300-93523 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 2mg 4450
304-93521 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 10mg 10680

Phos-tag Acrylamide (AAL-107)     Wako Cat. #304-93521 (10 mg)]Protocol(点击进入下载)


Phos-tag Acrylamide (AAL-107)   Wako Cat. #300-93523 (2 mg)]Protocol(点击进入下载)

Phos-tag ™ Acrylamide使用的相关问题解答

【检测】
Q. 可检测磷酸化蛋白吗?
A. 可以,用定性染色法(如考马斯亮蓝)染色,再检测条带的强弱即可。推荐使用产品如 “Quick-CBB
PLUS”。
【相关产品】 Quick-CBB PLUS(产品编号178-00551,1 L;产品编号174-00553,250 mL)
【分离】

Q. 此产品可分离多大的蛋白 (kDa) ?
A. 据文献报道,可分离 350 kDa 的磷酸化蛋白(20 μM Phos-tag, 3% 丙烯酰胺 + 0.5% 琼脂糖)。
【参考文献】Proteomics , 9, 4098-4101 (2009), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Uchijima, and K. K
* 添加琼脂糖,可增强凝胶强度。

Q. 如何提高分辨率?
A. 一般情况下,较高浓度的Phos-tag ™ 可以获得较高的分辨率。然而,增加Phos-tag ™ 的浓度会引起整
个蛋白电泳的速度成比例地变慢。

【染色】
Q. 除考马斯亮蓝外,凝胶是否可以用银染、荧光染色和阴性染色?
A. 可以。
【相关产品】Silver Stain 2 Kit Wako(产品编号291-50301; 10 sheets), Silver Stain Kit Wako (产
品编号299-13841; 10 sheets); Negative Gel Stain MS Kit(产品编号293-57701; 20 tests)

Q. CBB 染色后,脱色效果不好?
A. 脱色时可用微波炉略微加热。
方法:把染色后的凝胶放入100 mL 去离子水中,放入几张面巾纸,用微波炉略微加热数分钟,更换去离
子水与面巾纸。重复操作3-4 次。

【试剂及凝胶的配制】
Q. 除此产品外,还需要哪些试剂和仪器?
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余试剂和仪器与常规SDS-PAGE 相同。

【试剂及凝胶的配制】
Q. 除此产品外,还需要哪些试剂和仪器?
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余试剂和仪器与常规SDS-PAGE 相同。

Q. 实验中需要的甲醇与MnCl 是哪个级别的试剂?
A. 都是市售分析纯。

【样品要求】
Q. 样品必须是纯化的蛋白吗?是否可以用细胞裂解液?
A. 不一定是纯化的蛋白,细胞裂解液也可以。如果是纯化的样品,做SDS-PAGE 就可以。如果是蛋白裂解液
则需要做免疫印迹。

【Phos-tag ™ Acrylamide 的使用】
Q. 该产品10mg 包装可做多少次实验?
A. 取决于 Phos-tag ™的使用浓度,如:10 mg 包
装,若凝胶厚1 mm,宽9 cm,长7.7 cm,则
Phos-tag ™ 20 μM 可制 100 块胶,50 μM40 块,
100 μM20 块。其他包装及对应次数见右图。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 配制胶】
Q. 如何配制Phos-tag ™ SDS-PAGE 胶?
A. 只需在配常规SDS-PAGE 胶时加入Phos-tag ™ Acrylamide 和MnCl2。凝胶时间略长于常规SDSPAGE
。配制好的凝胶在几天内会不稳定,建议现用现配。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 操作】
Q. 每孔样品的上样量是多少?
A. 纯化蛋白:1-5 μg(CBB 染色法),组织细胞抽提液:10-30 μg(请根据蛋白表达量进行调整)。
※ 以上为估计值,请先用适量的样品进行常规蛋白免疫印迹、SDS-PAGE 来摸索。

【凝胶强度】
Q. 凝胶容易破损,请问要如何改善?
A. 丙烯酰胺浓度低的凝胶容易破损,因此,提高亚甲基双丙烯酰胺对丙烯酰胺的比
例(如24:1)即可改善。
【配制好的含Phos-tag ™ 的凝胶稳定性】

Q. 配制好的含Phos-tag ™ Acrylamide 的凝胶可存放多久?
A. 配制好的凝胶在几天内会不稳定,因此建议现用现配。
【Phos-tag ™溶液稳定性】

Q. 溶于甲醇和水中的母液可保存多久?
A. 据报道,4 ℃避光条件下能保存6 个月以上。

【试剂制备】
Q. Phos-tag ™ 的浓度与溶液中Mn2+ 的摩尔比例为多少?
A. Phos-tag ™ 丙烯酰胺与Mn2+ 的摩尔比应该为1:2,两个Mn2+ 离子结合一个
Phos-tag ™ 分子(如图1)。

Q. 按照实验流程中的方法配制Phos-tag ™,结果出现混浊,这正常吗?
A. 正常。混浊是由于甲醇造成的,静置一会,溶液就会变得澄清。

Q. 可否仅用水来溶解Phos-tag ™?
A. 可以仅用水溶,只是比溶解在含甲醇的水中时间长些。若不能完全溶解,离心,
取上清使用。

【分子marker】
Q. 可使用哪种预染marker ?
A. 一般的预染marker 在Phos-tag ™ 凝胶里条带会歪曲(如图2)。使用和光的WIDE-VIEW ™ Prestained
Protein Size Marker Ⅲ(产品编号230-02461)效果会好一些,可作为转膜效率的标记,但是无法推断
分子量。请单独留出一泳道。

【有ATP 存在下的磷酸化反应】
Q. 磷酸化反应液中存在ATP,是否会对电泳造成影响?
A. ATP 浓度在2.0 mM 时不会有什么特殊影响。使用限量还不清楚。

【预制胶】
Q. 能否能将此产品与样品混合后,在普通预制胶中进行电泳?
A. 不可以。但可选择使用含有Phos-tag ™的预制胶SuperSep ™ Phos-tag ™ (参考p18)。

【DNA 的分离】
Q. Phos-tag ™ 适合用于分离DNA 吗?
A. 参考以下文献:
・A SNP genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis, Analytical Biochemistry ,
361, 294-298 (2007), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike (The phosphate group at DNA-terminal is
efficiently captured by Zn2+-Phos-tag ™ .)
・A mobility shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate affinity polyacrylamide gel
electrophoresis, Analytical Biochemistry , 378, 102-104 (2008), E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike

【实验结果分析】
Q. 为什么会出现条带弯曲、拖尾现象?
A. EDTA、无机盐类、表面活性剂都是造成条带偏移或者拖尾的原因。所以电泳前可先用TCA 沉淀法或者透
析把样品脱盐。在样品量不够的情况下,可在空的泳道中加入适量上样缓冲液(×1),随后再进行电泳。

Q. 电泳后,怎么判断这些条带是因为蛋白的磷酸化引起的?
A. 相同样品使用12.5% SuperSep ™ Ace(产品编号199-14971)进行电泳,确认目的蛋白没有出现多条带。

Q. 靶蛋白磷酸化与非磷酸化分离效果不佳,怎么办?
A. 请先确认作为阳性对照的β‐酪蛋白和作为阴性对照的经去磷酸化酶处理过的β‐酪蛋白的分离情况(产品编
号:038-23221)。如果确认能够分离的话,可能本产品的Phos-tag ™ 浓度或者丙烯酰胺的浓度不能分
离目的蛋白的磷酸化和非磷酸化。

【后续实验】
Q. Phos-tag ™ Acrylamide 实验后进行质谱分析,需要进行特殊处理吗?
A. 无需进行特殊处理,即可进行质谱实验。

Q. 做免疫印迹实验时,是否可以用NC 膜代替PVDF 膜?A. 可以。但是Phos-tag ™ 与PVDF 膜亲和力更高,因此建议用PVDF 膜。

Q. 可以使用免疫印迹吗?
A. 可以,但由于转膜效果不好,必须用EDTA 处理除去凝胶中的金属离子。
方法: 把凝胶放入含有 10 mmol/L 的 EDTA 缓冲液(25 mmol/L Tris, 192 mmol/L Glycine, 10%
MeOH)中,在摇床上缓慢摇动10 分钟。更换EDTA 缓冲液,重复操作3 次。随后将凝胶放入不含有
EDTA 的缓冲液(25 mmol/l Tris, 192 mmol/l Glycine, 10 %MeOH)中,摇动10 分钟,最后将凝胶转
移至PVDF 膜或者NC 膜上。
※ 如果转膜效果仍然不理想,可多进行几次EDTA 处理或者增加EDTA 的浓度,或者适当优化转膜方法等。

References  参考文献:

    1. “Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc (II) complex”, E. Kinoshita, M. Takahashi, H. Takeda, M. Shiro, and T. Koike, Dalton Trans., 21, 1189-1193 (2004).
    1. “Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike, Mol. Cell.
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