UltraRIPA 脂筏提取缓冲液套装 UltraRIPA kit for Lipid Raft

UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代 RIPA 缓冲液

　　与常规的非变性细胞裂解缓冲液（RIPA buffer, 1% Triton X-100 等）相比，这款缓冲液套装（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏（Lipid Raft）蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中，在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取，有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

　　※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

◆细胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）

　　裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候，经常会使用 RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）缓冲液和1% Triton X-100 缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小，适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分析。另一方面，与具有很强的蛋白质变性作用的 SDS 缓冲液相比，增溶能力较弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏，故其又被称为 Detergent Resistant Membrane（DRM）。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

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　　脂筏（Lipid Raft）是由胆固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI锚定蛋白（GPI anchor protein）和棕榈酰化（palmitoylation）蛋白质组成的细胞膜构造，被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫突触是脂筏的代表性例子。

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脂筏示意图

◆特点

●	操作简单，能快速提取脂筏蛋白
●	使用两种类型的缓冲液（A buffer，B buffer）进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白
●	Buffer 提取的任何蛋白质都不会失活
●	A buffer 和一般的 RIPA buffer 成分相同＊。B buffer 含有表面活性剂，可以通过透析除去
●	适用于哺乳动物细胞/组织
●	使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA 法）、SDS-PAGE 和 Western blot 等
＊	1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate

◆缓冲液套装组成

　　●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

　　●　B buffer（10 mL）

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◆使用方法

1、	用 A buffer 溶解组织或培养细胞。
※	为了提高溶解效率，推荐使用均质或超声波破碎设备。
2、	进行离心分离，使 A buffe r中可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀）分离，分别回收。上层清液 A buffer 可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。
3、	往沉淀的 A buffer 不溶性组分中加入 B buffer，形成悬浊液。
4、	进行离心分离，与步骤2一样分离出可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀），分别回收。上层清液的 B buffer 可溶性组分中含有脂筏蛋白。
5、	可应用于各种实验。
※	A buffer 和 B buffer 不可用于 Bradford 法蛋白质定量。蛋白质定量请使用 BCA 检测。
※	使用本品 A buffer 和 B buffer 进行两个阶段的提取是最适宜的，也有只对细胞使用 B buffer 进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。

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UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较

	蛋白分离			蛋白结构	蛋白功能	应用
	胞质蛋白	膜蛋白
	胞质蛋白	非脂筏蛋白	脂筏蛋白
＞1%SDS buffer	○	○	○	╳	╳	SDS-PAGE
RIPA buffer	○	○	╳	○	○	酶分析法测定免疫沉淀 SDS-PAGE等
UltraRIPA	○	○	○	○	○	酶分析法测定免疫沉淀 SDS-PAGE等

◆应用例

从脂筏中提取总蛋白

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　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer 进行提取。提取后的总蛋白用 SDS-PAGE/银染色检测（左），用 BCA 法定量蛋白质（右）。相对于具有很强的蛋白质变性作用的２% SDS 缓冲液，UltraRIPA kit 能够提取 70% 以上的蛋白质。

　　※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。

脂筏标记蛋白的提取

　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加２% SDS，RIPA buffer 和 UltraRIPA kit B buffer，提取后进行 SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行 Western blot 检测。

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脂筏标记蛋白的免疫沉淀

　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分，通过 B buffer 提取脂筏标记蛋白。对 buffer 提取物使用脂筏标记蛋白 PSD95 的抗体和Ｇ蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗 PSD95 抗体通过 Western blot 检测进行确认。

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提取的蛋白质的酶活性测定

　　用１%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和２%SDS 溶解 CHO 细胞，测定溶解物中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。２%SDS 具有很强的蛋白质变性作用，在几乎完全失活的情况下，１% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和 UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。

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从脂筏中提取功能蛋白

　　用 UltraRIPA kit A buffer 溶解小鼠全脑组织后，回收 A buffer 不溶性组分。用 A buffer 分三次冲洗不溶性组分，消除 RIPA 可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加２% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和 B buffer，测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从 RIPA 不溶性组分中提取的蛋白质的量（左轴：黑）和所检测的脱磷酸酶的活性（右轴：红）的示意图。２% SDS buffer 能够从 RIPA 不溶性组分中很好地提取蛋白质，但容易导致蛋白质变性，完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer 不能提取蛋白质，活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer 所提取的蛋白质大约为２% SDS buffer 的 70%，且可以检测出较强的脱磷酸化活性。

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UltraRIPA kit B buffer 单独提取脂筏蛋白的可能性评价

※数据提供：东京大学药学院研究生院保健化学系

　　用 PBS 冲洗 COS-1 细胞，分别使用 SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和 UltraRIPA kit B buffer裂解，通过离心分离（14,000 rpm，5 min，4℃）可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的 SDS-PAGE 样品缓冲液变性溶解。脂筏标记 Flotilin1 的可溶部分通过 SDS-PAGE/western blot 测定。使用１% Triton X-100 和 RIPA buffer，大部分的 Flotilin 1 不溶性膜组分没有被溶解，而 UltraRIPA kit B buffer 几乎可以全部溶解。

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◆各buffer组成

●	SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）
●	UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate)
●	UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
●	1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）

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相关资料

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UltraRIPA kit for Lipid Raft

Q-1．	如果单独使用Ｂ缓冲液，溶解效率是否高于 RIPA 缓冲液？
A-1．	Ｂ缓冲液的溶解活性比 RIPA（Ａ缓冲液）高。本试剂盒的操作分为２个阶段，首先将 RIPA 不溶性组分回收并用Ｂ缓冲液将其溶解，并以浓缩和简单提取 RIPA 不溶性组分中含有的脂筏蛋白为目的而进行第２阶段的操作。但是，如果是直接用Ｂ缓冲液处理样本的时候，溶解率的确比 RIPA 高。
Q-2．	使用 ULTRARIPA^® Kit 是否只可以提取脂筏蛋白？
A-2．	多数研究认为，脂筏的细胞膜穴样内陷和神经突触中含有的组成蛋白不能用 Triton X-100 等温和的表面活性剂溶解，因此认为表面活性剂的不溶性组分（DRM）是生化脂质筏。本产品着眼于 RIPA 不溶性组分富含的脂筏蛋白，用Ｂ缓冲液进一步使其溶解，使得脂筏蛋白在非变性状态下溶解。因此，即使不是脂筏，只要是不溶于 RIPA 的样本，都可以使用本试剂盒进行检测（关于核蛋白的污染参见 Q-3）。本试剂盒使用溶解能力较高的 RIPA 缓冲液作为Ａ缓冲液，但是也可以用１% Triton X-100 等的裂解缓冲液代替 RIPA 缓冲液。
Q-3．	推荐使用均质或超声破碎设备，单独使用涡旋和移液是否不够充分？
A-3．	本产品采用Ａ缓冲液溶解后离心，并回收 RIPA 不溶性组分这样简单的步骤。因此，如果有细胞/组织的未破碎物或核残留的话，则可能污染 RIPA 不溶性组分。特别是 RIPA 缓冲液的核溶解效率较弱，如果不添加物理破碎，则核可能会大量残留在 RIPA 不溶性组分中。另一方面，由于Ｂ缓冲液的核溶解率较高，如果有核残留的话就会释放出 DNA，使溶液变浑浊。在Ａ缓冲液溶解时进行超声处理的话可以破坏核以及使基因组 DNA 片段化。核的污染可能会影响后续的应用，因此，我们强烈推荐使用均质或超声破碎设备。
Q-4．	Ｂ缓冲液的成分是什么种类的表面活性剂。听说表面活性剂的种类会影响电泳，我想知道它的成分。
A-4．	非常抱歉，Ｂ缓冲液的成分是非公开的。我们无法告诉您表面活性剂的种类。然而，我们可以确定Ｂ缓冲液不会影响电泳。
Q-5．	几乎无法看见Ａ不溶性组分。即使添加了Ｂ缓冲液也无法获取蛋白质量，怎么办？
A-5．	RIPA 缓冲液可以溶解90~95%包括膜蛋白在内的总蛋白（根据组织/细胞种的不同多少会有点差别）。因此，考虑蛋白质总量时，RIPA 不溶性组分中含有的蛋白为样本总体的10%以下。肉眼无法看见 RIPA 不溶性组分时，需要增加细胞数/组织量。想要提高Ｂ缓冲液溶解组分蛋白浓度时，减少添加至 RIPA 不溶性组分的Ｂ缓冲液的量就可以得到改善。我们建议您可以设置如下的阳性对照。
探讨样本量的阳性对照实验需要准备的试剂：２% SDS缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,150 mM NaCl，２% SDS）步骤：回收 RIPA 不溶性组分后，添加２%SDS缓冲液，通过进行蛋白质定量检测，可以预估 RIPA 不溶性组分中含有的蛋白质总量。
Q-6．	在Ａ缓冲液溶解组分中可以观察到脂筏标记物，有什么改善的方法吗。
A-6．	我们无法保证在其他方法中作为脂筏标记物被检测出的蛋白能否在Ａ缓冲液不溶性组分中获得。特别是根据脂筏标记物的不同，细胞种类/组织，有无外部信号也会有变动。我们会根据以下案例提供相关的改善方法，请酌情参考。例1：不溶于1％Triton X-100，但用RIPA缓冲液可以检测出可溶性组分。改善方法：可能是由于RIPA缓冲液（1%NP-40，0.1% SDS,0.5% sodium deoxycholate）的提取效率比1％Triton X-100强，所以能将其溶解。这时候，可以通过用1％Triton X-100缓冲液代替A缓冲液来浓缩以及溶解目的蛋白。例2：离心条件不足时，虽然不溶解，但是不沉淀。改善方法：虽然我们推荐的离心条件为10,000×g，但是根据目的蛋白的不同，离心10,000×g可能不足。这时，也有把离心条件调整为20,000×g之后得到改善的案例。因此，我们建议您可以探讨一下离心条件。
Q-7．	用B缓冲液洗脱的蛋白可以用于质谱分析吗？
A-7．	B缓冲液溶解的蛋白经过SDS-PAGE分离后，可以通过一般的蛋白质组学分析的顺序（切割凝胶，在凝胶中进行胰蛋白酶消化，提取肽以及脱盐操作）进行分析。
Q-8：	用B缓冲液提取后，我想用适合试验的缓冲液来置换它。可以通过透析去除B缓冲液的表面活性剂吗？
A-8：	B缓冲液含有的表面活性剂可以通过透析去除。请使用孔径为5 kDa的透析膜。但是，也有根据蛋白质的不同，在去除表面活性剂时也可能会聚集或变性，需要添加别的表面活性剂到透析缓冲液中。建议进行预实验。

参考文献

1.	Taruno A, Sun H, Nakajo K, et al. Post-translational palmitoylation controls the voltage gating and lipid raft association of CALHM1 channel. [J]. Journal of Physiology, 2017, 595(18).
2.	Tan, H.R., Tan, J. R., Ng, Y. Y., Chua, J. E., Chew, W. S., & Muralidharan,S., er al. (2017). Enriched Expression of Neutral Sphingomyelinase 2 in the Striatum is Essential for Regulation of Lipid Raft Content and Motor Coordination. Molecular Neurobiology, 55(7), 5741–5756.
3.	Yusuke, T. , Busra, A. , Mihail, S. , Nurhan, O. , & Shigeaki, S. . (2018). Extracellular glucose level regulates dependence on GRP78 for cell surface localization of multi-pass transmembrane proteins in Hela cells. FEBS Letters.
4.	Araki, K. , Kawauchi, K. , Sugimoto, W. , Tsuda, D. , Oda, H. , & Yoshida, R. , et al. (2019). Mitochondrial protein e2f3d, a distinctive e2f3 product, mediates hypoxia-induced mitophagy in cancer cells. Communications biology, 2, 3.
5.	Kishimoto, S. , & Fukushima, S. . (2018). Abstract 5837: acquired resistance to anticancer drug of high glucose-exposed hepg2. Cancer Research, 78(13 Supplement), 5837-5837.