PUREfrex ® 2.1
PUREfrex® 酶无细胞蛋白合成试剂盒
PUREfrex ® 2.1 保留PUREfrex ® 2.0 反应液组分的同时，对Solution Ⅰ进行细分，并提供还原剂，可根据需求选择更合适的蛋白合成条件。
特别推荐用于需严格控制氧化还原条件的含二硫键蛋白的合成。
可搭配添加剂DsbC Set (#PF005-0.5) 或 PDI Set（#PF006-0.5）使用。
PUREfrex ® 2.1不含分子伴侣，因此根据合成蛋白不同，可能无法形成正确的高阶结构，也可能无法溶解。这时，只需在蛋白合成时添加分子伴侣即可解决。GeneFrontier也推出了适用于本试剂盒的分子伴侣DnaK mix（#PF003-0.5）和GroE mix（#PF004-0.5）。
◆使用示例
需要二硫键结合的蛋白合成
使用不同种类的还原剂合成两种蛋白，并比较其合成量和活性。
结果显示，虽然合成量无差异，但二硫键的形成效率不同。
1. IgG的合成
IgG是通过二硫键（SS键）形成2条L链（轻链）和2条H链（重链）的四聚体结构。向含GSSG（氧化型谷胱甘肽）、大肠杆菌的二硫键异构酶 DsbC 和加入了分子伴侣的PUREfrex ® 反应液中添加不同种类的还原剂合成IgG，并比较其合成量。结果显示，虽然从SDS-PAGE的电泳分析中没有发现L链和H链合成量的显著差异，但四聚体结构的IgG形成效率根据使用的还原剂种类各异。
使用试剂盒
● PUREfrex ® 2.1（#PF213-0.25）
● DTT、GSH
● DsbC Set（#PF005-0.5）
● GSSG、DsbC
● DnaK Mix（#PF003-0.5）
● DnaK、DnaJ、GrpE
比较PUREfrex ® 合成的IgG和市售产品的抗原结合及内化的结果，请点击“使用重组无细胞蛋白合成系统PUREfrex开发全长IgG抗体的合成方法（2017年）”查看。
关于scFv和Fab合成相关的数据，请点击"根据蛋白合成能力提高的PUREfrex ® 2.0 进行Fab、Toxin及Immunotoxin的体外合成（2015年）"查看。
使用PUREfrex ® 试剂盒合成IgG, Fab, scFv的研究成果，可查看以下论文。
“Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system.”
Scientific reports 9, 671. (2019)
2. 酸性磷酸酶（AppA）活性
使用两种还原剂DTT和GSH（还原型谷胱甘肽），并添加改变浓度的GSSG（氧化型谷胱甘肽）和大肠杆菌的二硫键异构酶DsbC合成需要二硫键（SS键）的大肠杆菌 AppA*1，并比较其合成量和活性。结果显示，虽然从还原凝胶的电泳分析中没有发现AppA的合成量有显著差异，但根据使用的还原剂类型和浓度，合成的AppA的活性会有所不同。
使用试剂盒
● PUREfrex ® 2.1（#PF213-0.25）
● DTT、GSH
● DsbC Set（#PF005-0.5）
● GSSG、DsbC
*1） AppA有5个二硫键，其中一个为半胱氨酸残基间的二硫键。
◆产品组成
关于PUREfrex ® 2.1 中各Solution成分保密。
250 µL反应用
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产品规格 |
产品成分 |
开封后的储存温度*1 |
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SolutionⅠ*2 |
100 μL |
氨基酸、NTP、tRNA、酶底物等 |
-20℃ |
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Solution Ⅱ |
12.5 μL |
蛋白（30% 甘油溶液） |
-20℃或-80℃*3 |
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Solution Ⅲ |
25 μL |
核糖体（20 µM） |
-80℃*3 |
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Cysteine |
20 μL |
半胱氨酸（10 mM） |
-20℃ |
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DTT |
20 μL |
二硫苏糖醇（40 mM） |
-20℃ |
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GSH |
20 μL |
还原型谷胱甘肽（80 mM） |
-20℃ |
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DHFR DNA*4 碱基序列 |
10 μL |
含大肠杆菌DHFR基因的PCR产物 (20 ng/μL) |
-20℃ |
2 mL 反应用
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产品规格 |
产品成分 |
开封后的储存温度*1 |
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SolutionⅠ*2 |
800 μL |
氨基酸、NTP、tRNA、酶底物等 |
-20℃ |
|
Solution Ⅱ |
100 μL |
蛋白（30% 甘油溶液） |
-20℃或-80℃*3 |
|
Solution Ⅲ |
200 μL |
核糖体（20 µM） |
-80℃*3 |
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Cysteine |
160 μL |
半胱氨酸（10 mM） |
-20℃ |
|
DTT |
160 μL |
二硫苏糖醇（40 mM） |
-20℃ |
|
GSH |
160 μL |
还原型谷胱甘肽（80 mM） |
-20℃ |
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DHFR DNA*4 碱基序列 |
10 μL |
含大肠杆菌DHFR 基因的PCR产物 (20 ng/μL) |
-20℃ |
*1）试剂盒开封前，请在-80℃条件下储存。
*2）SolutionⅠ中不含半胱氨酸和还原剂。蛋白合成时，请根据需要添加试剂盒附带的半胱氨酸和还原剂。
*3）在-80°C条件下储存使用后的剩余反应溶液时，应在储存前使用液氮或干冰/乙醇等进行速冻。请根据需求进行分装，避免反复冻融。
*4）当用作蛋白合成的阳性对照时，请在20 µL合成反应溶液中添加1 µL DHFR DNA。
◆使用方法
使用PUREfrex ® 2.1 时，可在任意体积的反应液下进行蛋白合成。例如，在20 μL反应液中添加0.5 mM 半胱氨酸和4 mM GSH进行合成时，反应液的制备方法如下所示。添加形成二硫键（SS键）所需的添加剂 DsbC Set（#PF005-0.5）或 PDI Set（#PF006-0.5）进行合成时，请查看各产品的详情页。
1. 将SolutionⅠ、Cysteine、GSH在室温~37℃下加热1 min左右至完全融解，随后置于冰上。
2. 将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。
3. 将融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ、Cysteine、GSH轻轻涡旋后，离心并收集试管底部的内容物。
4. 根据下述配比制备反应液。（DNA 添加量为每kbp 0.5-3 ng/μL）
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Water |
7-X μL |
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Solution Ⅰ |
8 μL 注1 |
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Cysteine |
1 μL |
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GSH |
1 μL |
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Solution Ⅱ |
1 μL |
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Solution Ⅲ |
2 μL |
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模板DNA 注2 |
X μL |
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Total |
20 μL |
5．在37°C的加热块或水浴中反应 2~6 h，合成蛋白注3。
6．合成的蛋白可用于多种用途注4。
注意事项
注1）请注意，使用量与PUREfrex ® 2.0 不同。
注2）模板DNA请根据目标蛋白自行制备。关于制备方法，请参阅“关于模板DNA”。
注3）如果在气相恒温槽（如培养用恒温器）中进行反应，反应液的温度上升需花费更多的时间，合成量会有所降低。
注4）通过SDS-PAGE确认合成时，请用水稀释反应液后进行电泳。详情请点击“PUREfrex反应液的SDS-PAGE”查看。
◆使用注意事项
PUREfrex ® 为研究用试剂，不可用于包含人在内的动物给药、临床和诊断等其他用途。此外，请勿用于食品或家庭用途。
使用 PUREfrex ® 时，请使用不含RNase的水、试剂和设备。 此外，建议佩戴手套和口罩。