wako磷酸化蛋白电泳试剂- Phos-tag (TM) Acrylamide

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磷酸化蛋白电泳试剂——wako Phos-tag (TM) Acrylamide

什么是Phos-tag™

Phos-tag ™ 是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子，结合特异性与氨基酸的种类和序列无关，无放射性，无需特意制备磷酸化抗体。它可用于磷酸化蛋白的分离（Phos-tag™ Acrylamide）、Western Blot 检测（Phos-tag ™ Biotin）、蛋白纯化 （Phos-tag ™ Agarose）及质谱分析MALDI-TOF/MS （Phos-tag ™ Mass Analytical Kit） 。

Phos-tag的基本结构：

 

 

 

 

 

 

1. Phos-tag ™ Acrylamide 介绍

Phos-tag™ Acrylamide SDS-PAGE可根据迁移率不同，区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。该方法只需在常规的SDS-PAGE胶中添加Phos-tag™ Acrylamide和MnCl2即可进行实验（制胶过程中添加，如需详细说明请联系我们）。

特点
# 非放射性元素，非荧光物质
# 磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带
# 操作简便，与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似
# Phos-tag™ 的结合特异性与氨基酸种类、序列无关
# Phos-tag™ SDS-PAGE实验后，可进行常规的免疫组化、质谱等
# 性质稳定，溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月
# 磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测
# 不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来

原理

应用

1、黄色粘性油状物质；

2、在4度可保存至少一年；

3、Phos-tagTM与丙烯酰胺（Acrylamide，SDS-PAGE分离胶主要成分)结合分离磷酸化和非磷酸化蛋白。

SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子（Zn2+或者Mn2+）和Phos-tagTM Acrylamide。

在蛋白电泳过程中，磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tagTM Acrylamide发生特异性结合，导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。

Phos-tag® Acrylamide可根据迁移率不同，区分磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白。无放射性、非化学物质标记。不同位点磷酸化修饰的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来。

操作过程与普通SDS-PAGE相类似。Phos-tagTM的特异性结合与氨基酸种类、序列无关。

适用于免疫印迹、质谱分析等后续工作。可识别磷酸化和非磷酸化蛋白。

Phos-tagTM母液可稳定保存至少3个月。

可检测出具有不同磷酸基团数目的蛋白。无需特意制备磷酸化抗体。

产品编号 产品名称 规格 原价
304-93526 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution 0.3ml 2670
300-93523 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 2mg 4450
304-93521 Phos-tag™ Acrylamide AAL-107 10mg 10680

Phos-tag Acrylamide (AAL-107)     Wako Cat. #304-93521 (10 mg)]⇒ Protocol(点击进入下载)


Phos-tag Acrylamide (AAL-107)   Wako Cat. #300-93523 (2 mg)]⇒ Protocol(点击进入下载)

Phos-tag ™ Acrylamide使用的相关问题解答

【检测】
Q. 可检测磷酸化蛋白吗？
A. 可以，用定性染色法（如考马斯亮蓝）染色，再检测条带的强弱即可。推荐使用产品如 “Quick-CBB
PLUS”。
【相关产品】 Quick-CBB PLUS（产品编号178-00551，1 L；产品编号174-00553，250 mL）
【分离】

Q. 此产品可分离多大的蛋白 (kDa) ？
A. 据文献报道，可分离 350 kDa 的磷酸化蛋白（20 μM Phos-tag, 3% 丙烯酰胺 + 0.5% 琼脂糖）。
【参考文献】Proteomics , 9, 4098-4101 (2009), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Uchijima, and K. K
* 添加琼脂糖，可增强凝胶强度。

Q. 如何提高分辨率？
A. 一般情况下，较高浓度的Phos-tag ™ 可以获得较高的分辨率。然而，增加Phos-tag ™ 的浓度会引起整
个蛋白电泳的速度成比例地变慢。

【染色】
Q. 除考马斯亮蓝外，凝胶是否可以用银染、荧光染色和阴性染色?
A. 可以。
【相关产品】Silver Stain 2 Kit Wako（产品编号291-50301; 10 sheets）, Silver Stain Kit Wako （产
品编号299-13841; 10 sheets）； Negative Gel Stain MS Kit（产品编号293-57701; 20 tests）

Q. CBB 染色后，脱色效果不好？
A. 脱色时可用微波炉略微加热。
方法：把染色后的凝胶放入100 mL 去离子水中，放入几张面巾纸，用微波炉略微加热数分钟，更换去离
子水与面巾纸。重复操作3-4 次。

【试剂及凝胶的配制】
Q. 除此产品外，还需要哪些试剂和仪器？
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余试剂和仪器与常规SDS-PAGE 相同。

【试剂及凝胶的配制】
Q. 除此产品外，还需要哪些试剂和仪器？
A. 需10 mM 的MnCl2 溶液。其余试剂和仪器与常规SDS-PAGE 相同。

Q. 实验中需要的甲醇与MnCl 是哪个级别的试剂？
A. 都是市售分析纯。

【样品要求】
Q. 样品必须是纯化的蛋白吗？是否可以用细胞裂解液？
A. 不一定是纯化的蛋白，细胞裂解液也可以。如果是纯化的样品，做SDS-PAGE 就可以。如果是蛋白裂解液
则需要做免疫印迹。

【Phos-tag ™ Acrylamide 的使用】
Q. 该产品10mg 包装可做多少次实验？
A. 取决于 Phos-tag ™的使用浓度，如：10 mg 包
装，若凝胶厚1 mm，宽9 cm，长7.7 cm，则
Phos-tag ™ 20 μM 可制 100 块胶，50 μM40 块，
100 μM20 块。其他包装及对应次数见右图。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 配制胶】
Q. 如何配制Phos-tag ™ SDS-PAGE 胶？
A. 只需在配常规SDS-PAGE 胶时加入Phos-tag ™ Acrylamide 和MnCl2。凝胶时间略长于常规SDSPAGE
。配制好的凝胶在几天内会不稳定，建议现用现配。

【Phos-tag ™ SDS-PAGE 操作】
Q. 每孔样品的上样量是多少？
A. 纯化蛋白：1-5 μg（CBB 染色法），组织细胞抽提液：10-30 μg（请根据蛋白表达量进行调整）。
※ 以上为估计值，请先用适量的样品进行常规蛋白免疫印迹、SDS-PAGE 来摸索。

【凝胶强度】
Q. 凝胶容易破损，请问要如何改善？
A. 丙烯酰胺浓度低的凝胶容易破损，因此，提高亚甲基双丙烯酰胺对丙烯酰胺的比
例（如24:1）即可改善。
【配制好的含Phos-tag ™ 的凝胶稳定性】

Q. 配制好的含Phos-tag ™ Acrylamide 的凝胶可存放多久？
A. 配制好的凝胶在几天内会不稳定，因此建议现用现配。
【Phos-tag ™溶液稳定性】

Q. 溶于甲醇和水中的母液可保存多久？
A. 据报道，4 ℃避光条件下能保存6 个月以上。

【试剂制备】
Q. Phos-tag ™ 的浓度与溶液中Mn2+ 的摩尔比例为多少？
A. Phos-tag ™ 丙烯酰胺与Mn2+ 的摩尔比应该为1:2，两个Mn2+ 离子结合一个
Phos-tag ™ 分子（如图1）。

Q. 按照实验流程中的方法配制Phos-tag ™，结果出现混浊，这正常吗？
A. 正常。混浊是由于甲醇造成的，静置一会，溶液就会变得澄清。

Q. 可否仅用水来溶解Phos-tag ™？
A. 可以仅用水溶，只是比溶解在含甲醇的水中时间长些。若不能完全溶解，离心，
取上清使用。

【分子marker】
Q. 可使用哪种预染marker ？
A. 一般的预染marker 在Phos-tag ™ 凝胶里条带会歪曲（如图2）。使用和光的WIDE-VIEW ™ Prestained
Protein Size Marker Ⅲ（产品编号230-02461）效果会好一些，可作为转膜效率的标记，但是无法推断
分子量。请单独留出一泳道。

【有ATP 存在下的磷酸化反应】
Q. 磷酸化反应液中存在ATP，是否会对电泳造成影响？
A. ATP 浓度在2.0 mM 时不会有什么特殊影响。使用限量还不清楚。

【预制胶】
Q. 能否能将此产品与样品混合后，在普通预制胶中进行电泳？
A. 不可以。但可选择使用含有Phos-tag ™的预制胶SuperSep ™ Phos-tag ™ （参考p18）。

【DNA 的分离】
Q. Phos-tag ™ 适合用于分离DNA 吗？
A. 参考以下文献：
・A SNP genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis, Analytical Biochemistry ,
361, 294-298 (2007), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike (The phosphate group at DNA-terminal is
efficiently captured by Zn2+-Phos-tag ™ .)
・A mobility shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate affinity polyacrylamide gel
electrophoresis, Analytical Biochemistry , 378, 102-104 (2008), E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike

【实验结果分析】
Q. 为什么会出现条带弯曲、拖尾现象？
A. EDTA、无机盐类、表面活性剂都是造成条带偏移或者拖尾的原因。所以电泳前可先用TCA 沉淀法或者透
析把样品脱盐。在样品量不够的情况下，可在空的泳道中加入适量上样缓冲液（×1），随后再进行电泳。

Q. 电泳后，怎么判断这些条带是因为蛋白的磷酸化引起的？
A. 相同样品使用12.5% SuperSep ™ Ace（产品编号199-14971）进行电泳，确认目的蛋白没有出现多条带。

Q. 靶蛋白磷酸化与非磷酸化分离效果不佳，怎么办？
A. 请先确认作为阳性对照的β‐酪蛋白和作为阴性对照的经去磷酸化酶处理过的β‐酪蛋白的分离情况（产品编
号：038-23221）。如果确认能够分离的话，可能本产品的Phos-tag ™ 浓度或者丙烯酰胺的浓度不能分
离目的蛋白的磷酸化和非磷酸化。

【后续实验】
Q. Phos-tag ™ Acrylamide 实验后进行质谱分析，需要进行特殊处理吗？
A. 无需进行特殊处理，即可进行质谱实验。

Q. 做免疫印迹实验时，是否可以用NC 膜代替PVDF 膜？A. 可以。但是Phos-tag ™ 与PVDF 膜亲和力更高，因此建议用PVDF 膜。

Q. 可以使用免疫印迹吗？
A. 可以，但由于转膜效果不好，必须用EDTA 处理除去凝胶中的金属离子。
方法： 把凝胶放入含有 10 mmol/L 的 EDTA 缓冲液（25 mmol/L Tris, 192 mmol/L Glycine, 10%
MeOH）中，在摇床上缓慢摇动10 分钟。更换EDTA 缓冲液，重复操作3 次。随后将凝胶放入不含有
EDTA 的缓冲液（25 mmol/l Tris, 192 mmol/l Glycine, 10 %MeOH）中，摇动10 分钟，最后将凝胶转
移至PVDF 膜或者NC 膜上。
※ 如果转膜效果仍然不理想，可多进行几次EDTA 处理或者增加EDTA 的浓度，或者适当优化转膜方法等。

References  参考文献：

    1. “Recognition of phosphate monoester dianion by an alkoxide-bridged dinuclear zinc (II) complex”, E. Kinoshita, M. Takahashi, H. Takeda, M. Shiro, and T. Koike, Dalton Trans., 21, 1189-1193 (2004).
    1. “Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike, Mol. Cell.
      Proteomics      , 5, 749-757 (2006).
    1. “A single nucleotide polymorphism genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Anal. Biochem., 361, 294-298 (2007).
    1. “Label-free kinase profiling using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita-Kikuta, Y. Aoki, E. Kinoshita, and T. Koike, Mol. Cell. Proteomics, 6, 356-366 (2007).
    1. “Separation of a phosphorylated-His protein using phosphate-affinity Polyacrylamide gel”, S. Yamada, H. Nalkamura, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and Y. Shiro, Anal. Biochem., 360, 160-162 (2007).
    1. “A mobility-shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis”, E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike, Anal. Biochem., 378, 102-104 (2008).
    1. “Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, M. Matsubara, S. Yamada, H. Nakamura, Y. Shiro, Y. Aoki, K. Okita, and T. Koike, Proteomics, 8, 2994-3003 (2008).
    1. “FANCI phosphorylation functions as a molecular switch to turn on the Fanconi anemia pathway”, M. Ishiai, H. Kitao, A. Smogorzewska, J. Tomida, A. Kinomura, E. Uchida, A. Saberi, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, S. Tashiro, S. J. Elledge, and M. Takata, Nature Struct. Mol. Biol., 15, 1138-1146 (2008).
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    1. “Phosphate-affinity Gel Electrophoresis Using a Phos-tag Molecule for Phosphoproteome Study”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Current Proteomics, 6, 104-121 (2009).
    1. “Mobility shift detection of phosphorylation on large proteins using a Phos-tag SDS-PAGE gel strengthened with agarose”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Ujihara, and T. Koike, Proteomics, 9, 4098-101 (2009).
  2. “Separation and detection of large phosphoproteins by using Phos-tag SDS-PAGE”, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Nature Protocols, 4, 1513-21 (2009).