PUREfrex® 2.0 mini
自2022年12月起，PUREfrex® 试剂盒内的Solution Ⅰ的原材料已更换，具体详情请点击：PUREfrex® 系列试剂盒部分组成及制备方法变更通知
PUREfrex® 2.0 mini 是PUREfrex® 系列产品的入门级产品，推荐首次使用PUREfrex® 产品的客户使用。试剂盒还包含制备模板DNA所需的通用引物。
◆实验流程
1. 模板DNA的设计与制备
模板DNA的设计是PUREfrex® 进行蛋白合成的重要步骤。
模板DNA需自行制备，制备要点及注意事项等请参考”关于模板DNA“。
2. 确认目标蛋白的合成
蛋白合成时，向含有PUREfrex® 2.0 mini 的Solution Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合反应液中添加已制备的模板DNA，同时进行转录和翻译反应。
使用PUREfrex® 合成功能蛋白的基本步骤如下：
首先，客户需自行制备适用于PUREfrex® 合成的模板DNA，并确认是否可以合成目标蛋白；然后，探讨模板DNA的碱基序列，直至蛋白合成量可在SDS-PAGE上确认；确认合成后，再确认可溶性和活性。
PUREfrex® 2.0 mini 包含以下流程图“2-1. 确认合成蛋白”步骤为止所需的试剂。
3. 评估合成蛋白的可溶性和活性
PUREfrex® 2.0 mini 不含分子伴侣，因此根据合成蛋白不同，可能无法形成正确的高阶结构，也可能出现无法溶解的情况。这时，只需在蛋白合成时添加分子伴侣即可解决。GeneFrontier也推出了适用于本试剂盒的分子伴侣DnaK mix（#PF003-0.5）和GroE mix（#PF004-0.5）。
PUREfrex® 2.0 mini含有GSH（还原型谷胱甘肽），可在还原条件下进行蛋白合成反应。合成需要形成二硫键（SS键：SS-bond或二硫桥：disulfide bridge）的蛋白时，建议使用PUREfrex®2.1（#PF213-0.25）作为蛋白合成反应液，并添加DsbC Set (#PF005-0.5)或PDI Set (#PF006-0.5)使用。
◆产品组成
PUREfrex®2.0 mini中各Solution具体成分保密。
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产品规格 |
产品成分 |
开封后的储存温度*1 |
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SolutionⅠ |
50 μL |
氨基酸、NTP、tRNA、酶底物等 |
-20℃ |
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Solution Ⅱ |
5 μL |
蛋白（30%甘油溶液） |
-20℃或-80℃*2 |
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Solution Ⅲ |
10 μL |
核糖体（20 µM） |
-80℃*2 |
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DHFR DNA*3 碱基序列 |
10 μL |
含大肠杆菌DHFR基因的PCR产物(20 ng/μL) |
-20℃ |
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T7PRO-SD primer *4 碱基序列 |
5 μL |
两步PCR用引物（10 µM） |
-20℃ |
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RNase-Free Water |
500 μL |
无RNase水 |
-20℃ |
*1）试剂盒开封前，请在-80℃条件下储存。
*2）在-80°C条件下储存使用后的剩余反应溶液时，应在储存前使用液氮或干冰/乙醇等进行速冻。请根据需求进行分装，避免反复冻融。
*3）用作蛋白合成的阳性对照时，请在20 µL合成反应溶液中添加1 µL DHFR DNA。
*4）使用两步PCR制备模板DNA时，T7PRO-SD primer 是所有蛋白的通用引物。
◆模板DNA的设计和制备方法
模板DNA的设计是使用PUREfrex® 2.0 mini 进行蛋白合成的重要步骤。详情请查看”关于模板DNA“。该文章根据客户的氨基酸序列考虑制备模板的要点，提供适用的基因序列。
◆使用方法
使用PUREfrex®2.0 mini时，可在任意体积的反应液下进行蛋白合成。例如，20 μL时的制备方法如下所示。
1. 将SolutionⅠ在室温~37℃下加热1 min左右至完全融解，随后置于冰上。
2. 将Solution Ⅱ和Solution Ⅲ置于冰上融解。
3. 将融解的SolutionⅠ，Ⅱ，Ⅲ轻轻涡旋后，离心并收集试管底部的内容物。
4. 根据下述配比制备反应液。（DNA 添加量为每kbp 0.5-3 ng/μL）
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RNase-Free Water |
7-X μL |
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Solution Ⅰ |
10 μL |
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Solution Ⅱ |
1 μL |
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Solution Ⅲ |
2 μL |
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模板DNA 注1 |
X μL |
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Total |
20 μL |
5．在37°C的加热块或水浴中反应 2~6 h，合成蛋白注2。
6．合成的蛋白可用于多种用途注3。
注意事项
注1） 模板DNA请根据目标蛋白自行制备。关于制备方法，请参阅“关于模板DNA”。
注2） 如果在气相恒温槽（如培养用恒温器）中进行反应，反应液的温度上升需花费更多的时间，合成量会有所降低
注3） 通过SDS-PAGE确认合成时，请用水稀释反应液后进行电泳。详情请点击“PUREfrex反应液的SDS-PAGE”查看。
◆使用注意事项
PUREfrex® 为研究用试剂，不可用于包含人在内的动物给药、临床和诊断等其他用途。此外，请勿用于食品或家庭用途。
使用 PUREfrex® 时，请使用不含RNase的水、试剂和设备。 此外，建议佩戴手套和口罩。