1.     Phos-tag® Acrylamide的溶解

5mmmol/ Phos-tag® 液体 (3v/v% 甲醇）：

1)    10mg  Phos-tag® Acrylamide 里加入 0.1mL 甲醇

2)    使用枪头搅拌混合直至完全溶解。

3)     加3.2mL 蒸馏水， 用枪头混匀。

2-8℃避光保存。不适合零度以下保存。建议保存时间6个月。

　　 注意：避免溶解过程出现白色悬浮颗粒。

2.     α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221），阳性对照（含有磷酸化和非磷酸化

　　 α-Casein），如何使用？

　　 用水或者上样buffer溶解。用水溶解后，冷冻保存。电泳条件：Phos-tag® 50umol/L,分离胶浓度 10%。

　　 电流：30mM，1小时。

 

3.     用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）进行磷酸化蛋白的去磷酸化反应体系。

37℃，过夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 μL
# 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 μL
# Sterilized water 39 μL
# Alkaline phosphatase（018-10693）. 0.3 unit / 1 μL有一点需要注意:ALP活性化使用Mg离子，相

　　 同的非磷酸化蛋白质用ALP处理的样品的条带和没有用ALP处理的样品的条带的位置不同。

 

4.     Phos-tag® SDS-PAGE实验没有成功分离磷酸化蛋白：

1） 使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作为阳性对照，确认实验条

件和试剂均没有问题。

2） 可使用Phos-tag®Biotin检测样品中是否有磷酸化蛋白。确认有磷酸化蛋白后，再通过

Phos-tag ®SDS-PAGE进行分离鉴定。

3） 经质谱鉴定有表达磷酸化蛋白，建议增大样品的含量，可使用Phos-tag ®Agarose进行磷酸化蛋白

的富集。磷酸化蛋白含量过低，会影响其分离效果。

4） 文献报道有表达磷酸化蛋白，或者同源蛋白有表达磷酸化蛋白的，建议用Phos-tag® Biotin先确认

样品中是否有磷酸化蛋白。

5） 建议样品的pH值在7左右。酸性或者碱性条件下，Mn2⁺-Phos-tag®与磷酸化基团的特异性结合较

差。

6） 避免样品中含有高浓度的还原剂，变性剂，表面活性剂等。β-巯基乙醇浓度不高于0.2M（或者5%）。

7） 进行Phos-tag® SDS-PAGE的佳样品是纯化的蛋白。如果是细胞裂解液，体外激酶反应液，组织均

浆液等，需要摸索佳的分离胶，Phos-tag® Acylamide的浓度。建议Phos-tag® Acrylamide浓度

从50uM开始摸索。

 

5.     Phos-tag®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验的优化建议：

1） 可以检测的样品包括体外激酶反应体系，细胞裂解液，组织均浆液。

2） 每孔样品的上样量是10~30ug（请根据蛋白表达量进行调整）

3） 制备样品中含有的还原剂、变性剂、螯合剂、钒酸等会使电泳条带发生弯曲或者拖尾。通过TCA沉淀或

渗析法降低杂质含量。

4） 建议样品的pH值在7左右。如果加入上样缓冲液后溶液显黄色或者橙色，加入Tris缓冲液调整pH值为7。

5） 目的蛋白分子量大于60kDa，分离胶的丙烯酰胺浓度为6%；目的蛋白分子量小于60kDa,分离胶的丙烯

酰胺浓度为8%。

6） 如果样品中含有大量蛋白，比如细胞裂解液，组织均浆液，Phos-tag® Acylamide浓度为5~25uM。

若目的蛋白浓度低，建议Phos-tag® Acylamide浓度为100uM。

7） Phos-tag ®SDS-PAGE凝胶用于Western Blotting实验，湿法转膜建议：10mM EDTA的转移缓冲液

处理凝胶10min，不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。强烈建议湿法转膜

8） Phos-tag® SDS PAGE半干法转膜建议：

              i.      电泳后用含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶，EDTA的浓度为 100mM。100mM EDTA的转移

缓冲液处理凝胶10min，不含有EDTA的转移缓冲液处理凝胶10min。重复3次。

             ii.      转膜的电流值提高2%~3%, 延长时间2成。

            iii.      转膜的缓冲液加SDS，加到大约0.05~0.2%，转膜效率会提高。

9） 使用目的蛋白的非磷酸化抗体即可。比如检测各种肿瘤细胞系中Src激酶活性实验，用Src的非磷酸化抗

体即可。

10） 和光的WIDE-VIEW^TM Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可检测作为转膜效率，但是无

法判断分子量。

11） 一般预染的蛋白marker在Phos-tag®SDS-PAGE中条带会弯曲，无法判断蛋白分子量。

12） 不能确认磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分离，请进行常规的SDS-PAGE，Western Blotting实验。比

对目的蛋白的迁移率。

13） 不能确认是因为蛋白发生磷酸化还是出现降解造成蛋白条带迁移，请进行常规的SDS-PAGE实验，确

认不会出现条带迁移。

14） 目的蛋白磷酸化与非磷酸化分离效果不佳，使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated

（038-23221）作为阳性对照，确认实验条件和试剂均没有问题。如果确认能够分离，调整分离胶，

Phos-tag® Acylamide的浓度。建议使用品质佳的MnCl2（139-00722）。